Obhajoba bakalářské práce - Kamila Herková

Created by Kamila Klavíková

🔹 17. 9. 2019 🔹 Porovnámí dostupných algoritmů predikce sestřihu rostlinné mRNA 🔹 obor bioinformatika

#PřF UK, #bioinformatika, #biologie, #prezentace

Porovnání dostupných algoritmů predikce sestřihu rostlinné mRNA

Bakalářská práce

Kamila Herková

vedoucí: doc. RNDr. Fatima Cvrčková, Dr.

Sestřih

• Syntéze proteinů předchází přepis DNA do prekurzorové mRNA (pre-mRNA), která není plně funkční.
• Proto dojde k úpravě zvané sestřih, kdy z pre-mRNA vznikne zralá mRNA.

Alternativní sestřih

• Z jedné pre-mRNA může vzniknout několik transkriptů s různými sekvencemi.
• Přispívá k rozmanitosti bílkovin, neboť jich je několikanásobně více než genů.

Metody pro predikci genů

• Hledají v zadané sekvenci úseky kódující geny: exony, introny a další funkční elementy, například nepřekládané oblasti.
• Využívají obvykle skryté Markovské modely.

Metody založené na sestavení transkriptomu

Tyto algoritmy jsou jedním z kroků procesu analýzy RNA dat (Song et al., 2018). K sestavení transkriptomu jsou dva hlavní přístupy.

Predikce s referenčním genomem

Hlavní kroky algoritmů:  Nejprve zarovnají čtení na zadaný genom. Například pomocí nástroje TopHat. Následně budují graf překryvů zachycující všechny možné izoformy. Na závěr prohledají graf a sestavují jednotlivé izoformy.

Metody de novo

Používají se v situaci, kdy nemáme dostupný kvalitně sestavený genom. Například při analýze nemodelového organismu s ekologickým nebo evolučním významem (Haas et al., 2013). Vygenerují všechna podslova délky k z jednotlivých čtení. Z nich sestrojí de Bruijnův graf a provedou zjednodušení. Prohledáním grafu sestaví jednotlivé transkripty.

Markovské modely

• Systém tvořený stavy x₁, ..., x_n, stav se mění v krocích. Nový stav závisí pouze na předchozím stavu, nezávisí na historii. Je popsán stochastickou maticí.

• Vývoj pravděpodobnostní distribuce u dostaneme jako u, Au, A²u, A³u, ..., tedy opakovaným násobením maticí A.
• Lze analyzovat metodami lineární algebry (vlastní čísla, atd.).

Neuronové sítě

Skryté Markovské modely

• Dodatečná informace ve formě pozorování. Známe pravděpodobnosti, že nastaly jednotlivé stavy vzhledem k pozorováním.

• Známe-li sekvenci pozorování, můžeme spřesnit výpočet pravděpodobnostní distribuce nebo počítat nejpravděpodobnější posloupnost stavů (Viterbiho algoritmus).
• V případě predikce sestřihu si lze zjednodušeně představovat model s dvěma stavy: exon a intron, pro které pozorování jsou určena analyzovanou sekvencí pre-mRNA.

Matematické metody

De Bruijnovy grafy

• Máme slova délky k. Chceme je naskládat přes sebe do řetězce tak, aby dvě po sobě jdoucí slova vždy sdílela k-1 znaků.

• V případě algoritmů pro predikci sestřihu jsou slova úseky ze sekvence, které se algoritmy snaží poskládat dohromady.

• De Bruijnův trik je sestrojit graf, ve kterém jsou slova délky k odpovídají hranám.
• Nalezením Eulerovského tahu poskládáme slova do řetězce.

Dvě sekvence: AAAGGTTGAGGCGTTT a AAAGGCGTTGAGGTTT

Dostupné online

Specifická nastavení pro rostliny

AUGUSTUS

Alternativní sestřih

Fgenesh, Fgenesh+, Fgenesh++

GenScan

• Nepředpokládá přesně jeden kompletní gen na vstupu, umožňuje řešit obecné situace, kdy sekvence obsahuje jeden nebo více částečných či kompletních genů.
• Skrytý Markovský model pro hledání kódovaných oblastí. Model bere v úvahu rozdíly v hustotě a struktuře genů. Nevyžaduje dodání podobného genu z proteinové databáze.
• Lze vybrat organismus ze tří možností: obratlovci, Arabidopsis, a kukuřice.

Gnomon

NetGene2

Alternativní sestřih

SOAPdenovo-Trans

Dostupné online

Trinity

Program je tvořen třemi nezávislými moduly:

• Inchworm rozloží čtení do unikátních kontigů, což jsou sekvence vzniklé zkombinováním čtení.
• Chrystalis shlukuje kontigy do souvislých komponent, pro které sestrojí de Bruijnovy grafy.
• Butterfly analyzuje de Bruijnovy grafy a sestrojuje všechny možné transkripty.

Oases

Cufflinks

• Hledá minimální počet transkriptů, která mohou vysvětlit všechna čtení v grafu.
• Využívá graf překryvů.

PASA

Dostupné online

StringTie

Alternativní sestřih

Lepší český překlad termínu „self-splicing introns“

Otázka: Neexistuje lepší český překlad termínu “self-splicing introns” než „sebe samy vystřihující introny“? Nechť případně autorka navrhne překlad, který nebude zatížen anglicismy.

Použitý překlad je podle článku Stanislava Mihulky ve Vesmíru (https://vesmir.cz/cz/casopis/archiv-casopisu/2001/cislo-2/o-puvodu-eukaryontnich-intronu.html). Není ustálený překlad. Dále se lze se s pojmenováními: introny, které jsou schopny sestřihávat samy sebe, auto-sestřih, auto-splicing.

Asi lepší překlad je „introny vystřihující samy sebe“ nebo „sebevystřihující introny“.

Obrázek 1.7: účel fluorescenčně značených nukleotidů v Sangerově sekvenování

Otázka: Dotaz k obrázku 1.7: K čemu se při uspořádání Sangerova sekvenování s detekcí na gelu, který je popsaný na tomto obrázku, přidávají do reakční směsi fluorescenčně značené nukleotidy?

Abychom mohli detekovat jednotlivé nukleotidy na elektroforéze. Pravdou je, že se toto uspořádání v praxi nepoužívá. Místo toho se využívá kapilární  elektroforéza.

Odpovědi na otázky

Výhody sekvenačních metod třetí generace pro získávání transkriptomových dat

Otázka: Autorka zmiňuje potenciál sekvenačních metod třetí generace pro získávání transkriptomických dat. Jaké vidí výhody těchto metod ve srovnání například s paired-end Illumina?

Umožňují rovnou identifikovat exony a introny. Odpádá sestavování transkriptů. Dále by mohly umožnit lepší kvantifikaci transkriptů.

Konkrétní příklady genomických projektů a použitých strategii

Otázka: Práce postrádá konkrétnější informace o použití uvedených algoritmů při sekvenování rostlin, proto by mohla uvést na některých konkrétních genomických projektech, jaká strategie byla použita a zda-li je patrný nějaký trend v používání různých algoritmů.

Sekvenování Suaeda aralocaspica (Wang et al. GigaScience, 8, 2019, 1–9)

• SoapdeNovo2

Sestavení genomu rýže (Du et al., 2017, Nature Communications)

• SOAPdenovo, cufflinks

Referenční genom pro Pisum sativum (Kreplak et al. NATURE GENETICS | VOL 51 | SEPTEMBER 2019 | 1411–1)

• SoapdeNovo2, StringTie, Trinity, PASA (která zahrnuje Evidence Modeler), AUGUSTUS, Fgenesh...

predikce sestřihu

Srovnání algoritmů

• Žádný z algoritmů není univerzálně nejlepší na všechno. Často lze jejich zkombinováním získat lepší výsledky.
• Žádný program pro sestavení transkriptomu nevyužívá kombinaci krátkých a dlouhých čtení. Tyto dva druhy čtení obsahují odlišné informace. Je zajímavým problémem sestrojit algoritmus, který by oba druhy čtení kombinoval.

Přehled algoritmů